冷凍干燥機的應用之微生物細菌的儲存方法

好氧菌冷凍干燥管的制備

1、安瓿管準備

安瓿管材料以中性玻璃為宜。清洗安瓿管時，先用2%鹽酸浸泡過夜，自來水沖洗干凈后，用蒸餾水浸泡至pH中性，干燥后、貼上標簽，標上菌號及時間，加入脫脂棉塞后，121℃下高壓滅菌15-20分鐘，備用。

2、保護劑的選擇和準備

保護劑種類要根據微生物類別選擇。配制保護劑時，應注意其濃度及pH值，以及滅菌方法。如血清，可用過濾滅菌；牛奶要先脫脂，用離心方法去除上層油脂，一般在100℃間歇煮沸2-3次，每次10-30分鐘，備用。

3、凍干樣品的準備

在適宜的培養條件下將細胞培養至靜止期或成熟期，進行純度檢查后（參見科技部自然科技資源平臺聯合管理辦公室文件《微生物菌種純度檢測技術規程》（試行）），與保護劑混合均勻，分裝。微生物培養物濃度以細胞或孢子不少于108-1010個/ml為宜（以大腸桿菌為例，為了取得每毫升1010個活細胞菌液2毫升-2.5毫升，只需10毫升瓊脂斜面兩支）。采用較長的毛細滴管，直接滴入安瓿管底部，注意不要濺污上部管壁，每管分裝量約0.1-0.2毫升，若是球形安瓿管，裝量為半個球部。若是液體培養的微生物，應離心去除培養基，然后將培養物與保護劑混勻，再分裝于安瓿管中。分裝安瓿管時間盡量要短，**在1-2小時內分裝完畢并預凍。分裝時應注意在無菌條件下操作。

4、預凍

一般預凍2小時以上，溫度達到-20℃到-35℃左右。

5、冷凍干燥

采用冷凍干燥機進行冷凍干燥。將冷凍后的樣品安瓿管置于冷凍干燥機的干燥箱內，開始冷凍干燥，時間一般為8-20小時。

6、真空封口及真空檢驗

將安瓿管頸部用強火焰拉細，然后采用真空泵抽真空，在真空條件下將安瓿管頸部加熱熔封。熔封后的干燥管可采用高頻電火花真空測定儀測定真空度。

7、保藏

安瓿管應低溫避光保藏。

8、質量檢查

冷凍干燥后抽取若干支安瓿管進行各項指標檢查，如存活率、生產能力、形態變異、雜菌污染等。

厭氧菌冷凍干燥管的制備

主要程序與需氧菌操作相同，注意保護劑的選擇和準備，保護劑使用前應在100℃的沸水中煮沸15分鐘左右，脫氣后放入冷水中急冷，除掉保護劑中的溶解氧。

復蘇方法

先用70%酒精棉花擦拭安瓿上部，將安瓿管頂部燒熱，用無菌棉簽沾冷水，在頂部擦一圈，頂部出現裂紋，用挫刀或鑷子頸部輕叩一下，敲下已開裂的安瓿管的頂端，用無菌水或培養液溶解菌塊，使用無菌吸管移入新鮮培養基上，進行適溫培養。